Calidad de péptidos: guía completa de COA, HPLC y pureza

Qué es la calidad de un péptido y por qué importa

Cuando un médico o un investigador evalúa un péptido, la primera pregunta no es farmacológica sino química: ¿el vial contiene la molécula declarada, en la cantidad declarada y sin contaminantes relevantes? La Agencia Europea de Medicamentos (EMA), en su guía sobre el desarrollo y la fabricación de péptidos sintéticos, vigente desde el 1 de junio de 2026, lo resume sin rodeos: la pureza es uno de los atributos críticos de calidad más importantes de esta clase de moléculas¹. Las impurezas no son un detalle técnico: una revisión de la Universidad de Gante muestra que pueden influir en los estudios funcionales iniciales y llevar a conclusiones erróneas².

La Organización Mundial de la Salud (OMS) distingue dos problemas. Los productos de calidad deficiente son los que no cumplen sus estándares y especificaciones, a menudo por malas prácticas de fabricación o un control de calidad insuficiente; los falsificados son los que tergiversan de forma deliberada su identidad, su composición o su origen³. Según la misma ficha, al menos 1 de cada 10 medicamentos en los países de ingresos bajos y medianos es de calidad deficiente o falsificado³. Esta guía recorre las dos caras: cómo se mide la calidad (certificado de análisis, HPLC, masas, contenido, endotoxinas), cómo se conserva (estabilidad) y qué se ha encontrado cuando los laboratorios analizan productos del mercado.

De dónde salen las impurezas: síntesis en fase sólida

La mayoría de los péptidos se fabrica hoy por síntesis en fase sólida: la cadena se construye sobre una resina mediante ciclos repetidos de desprotección, lavado y acoplamiento de aminoácidos, y al final se corta de la resina¹². Cada paso deja su huella posible. Un acoplamiento incompleto produce secuencias con deleción (falta un aminoácido); un aminoácido acoplado dos veces produce secuencias con inserción; la epimerización genera diastereómeros; los grupos protectores que no se eliminan del todo dejan aductos, y al cortar la cadena se liberan especies reactivas que pueden atacar a triptófano, tirosina o metionina¹². A eso se suman oxidaciones, dímeros y oligómeros².

Hay además impurezas que no son péptidos: reactivos del proceso, solventes residuales, impurezas elementales y contraiones como el trifluoroacetato (TFA), que procede de la propia síntesis o de la purificación¹². La EMA señala que los péptidos sintéticos suelen usar acetato como contraión, aunque también existen sales de trifluoroacetato o de cloruro, y pide definir el tipo de contraión y limitar su cantidad¹. En el estudio de Gante, la mayoría de las impurezas relacionadas encontradas eran precisamente secuencias a las que les faltaban aminoácidos⁴.

Pureza por HPLC: qué mide y qué no

La cifra que aparece en casi todos los certificados («pureza ≥98 %») sale de una cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) en fase reversa con detector ultravioleta. Es una normalización de áreas: el área del pico principal frente a la suma de todos los picos detectados. Significa que al menos el 98 % de la señal ultravioleta integrada corresponde al pico principal; no significa que el 98 % del polvo sea péptido. La lectura detallada de ese número, con sus longitudes de onda y umbrales de notificación, está en cómo leer el certificado de análisis de un péptido.

El método tiene límites que conviene conocer. Una impureza que eluye junto al pico principal queda escondida dentro de él; la EMA pide tener en cuenta ese riesgo de coelución y, si dos impurezas aparecen como un solo pico, aplicar el umbral de calificación de 1,0 %¹. Para los péptidos sintéticos, la Farmacopea Europea establece que las impurezas relacionadas se notifican por encima del 0,1 %, se identifican por encima del 0,5 % y se califican por encima del 1,0 %¹. Un buen certificado declara el método y adjunta el cromatograma con los picos integrados; la EMA pide copias de los cromatogramas relevantes¹.

Identidad: espectrometría de masas y métodos ortogonales

La pureza dice cuánto del material es un solo componente; no dice cuál. Esa es la función de la espectrometría de masas. La ionización por electrospray, descrita para biomoléculas grandes por Fenn y colaboradores en 1989, produce iones con varias cargas a partir de los cuales se reconstruye la masa de la molécula⁵. La EMA pide espectros representativos y tablas con las masas teóricas y observadas¹.

La masa tiene puntos ciegos: dos diastereómeros pesan exactamente lo mismo. Por eso la EMA recomienda, para identificar un péptido en la especificación y la liberación de un lote, al menos dos métodos ortogonales: masa, tiempo de retención relativo, LC-MS, mapeo peptídico, bioactividad, análisis de aminoácidos o resonancia magnética nuclear¹. El ejemplo práctico más citado es el del grupo de Gante: entre los péptidos encargados con pureza ≥95 %, el compuesto principal de una muestra tenía una estructura distinta de la solicitada⁴, un error que una cifra de pureza no habría revelado.

Pureza no es contenido: contraiones, agua y péptido neto

Este es el punto que más confusión genera. Un polvo liofilizado con 99 % de pureza por HPLC contiene además contraiones, agua y a veces solventes. El caso mejor documentado es un candidato a material de referencia certificado de angiotensina II: el contraión TFA representaba casi el 25 % de la masa y el valor de pureza asignado fue de 691 ± 9 mg/g⁶. Es decir, alrededor del 69 % del polvo era péptido. La EMA, por su parte, establece que los límites de una valoración por cromatografía se expresan sobre la sustancia anhidra y libre de contraión¹.

El contraión no solo pesa: también puede actuar. En cultivos de osteoblastos, el TFA a 10⁻⁸–10⁻⁷ M redujo el número de células, y las sales de TFA de amilina y calcitonina impidieron detectar un efecto proliferativo o sugirieron uno antiproliferativo inexistente; los autores recomendaron convertir los péptidos a clorhidrato antes de evaluar su efecto biológico⁷. La cuestión de las sales tiene consecuencias propias en los GLP-1, revisadas en GLP-1 magistrales: sales, impurezas y anticuerpos.

El agua es el tercer componente. La EMA advierte que los péptidos suelen ser polvos muy higroscópicos, pide indicar la higroscopicidad y espera que el contenido de agua forme parte de los protocolos de estabilidad¹. La consecuencia práctica es saber si los miligramos de una etiqueta se refieren al polvo o al péptido neto.

Cómo leer un certificado de análisis (COA)

El certificado de análisis resume las pruebas hechas a un lote concreto. La lista de la EMA para la especificación de un péptido sintético sirve como plantilla para leer cualquiera¹. Cada prueba responde una pregunta distinta:

• Aspecto e identificación (masa más un segundo método): ¿es la molécula declarada?¹⁵
• Pureza (impurezas totales e individuales): ¿cuánto de la señal corresponde al pico principal?¹
• Impurezas de alto peso molecular (agregados, dímeros, oligómeros): ¿se ha agregado el péptido?¹
• Valoración o contenido (por ejemplo, por LC, análisis de aminoácidos o qNMR): ¿cuánto péptido hay en el polvo?¹⁶
• Contraión y TFA residual: ¿qué sal es y cuánto pesa?¹⁷
• Agua y solventes residuales: ¿qué más hay en el polvo?¹
• Endotoxinas bacterianas y pureza microbiológica: ¿es apto desde el punto de vista microbiológico?¹⁸

Las endotoxinas merecen una nota aparte. Se miden con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), que desde hace más de 30 años se acepta en lugar de la prueba de pirógenos en conejos y que describe el capítulo <85> de la Farmacopea de EE. UU.⁸. Estéril y libre de endotoxinas no son lo mismo: los viales de semaglutida analizados en un estudio de vigilancia de mercado no tenían microorganismos viables, pero todos contenían endotoxinas, entre 2,16 y 8,95 EU/mg¹⁸. Un resultado bien informado lleva cifra, unidades y límite.

Por último, un certificado solo vale para el lote que describe: número de lote, fechas del análisis, método, datos brutos y firma. La EMA espera trazabilidad del material desde la síntesis hasta el principio activo final¹. Para quien empieza, leer la etiqueta y el certificado de análisis, sin miedo explica lo mismo paso a paso.

Estabilidad: del polvo liofilizado al vial reconstituido

Un péptido de alta pureza puede degradarse después. La EMA enumera las rutas habituales de degradación de los péptidos sintéticos: oxidación, hidrólisis, isomerización, deamidación, formación de imida cíclica (aspartimida), dicetopiperazina y ácido piroglutámico, β-eliminación, intercambio de disulfuros y acetilación, entre otras¹. Varias están bien cuantificadas. La deamidación de asparagina y glutamina depende mucho de los aminoácidos vecinos: un modelo con 648 combinaciones de secuencia incluyó vidas medias muy largas, de 2–50 años en algunas secuencias⁹. Los residuos de ácido aspártico se hidrolizan en medio muy ácido y se isomerizan por encima de pH 6¹⁰. La fotooxidación afecta sobre todo a triptófano, tirosina, fenilalanina y cisteína/cistina¹².

El polvo liofilizado no es inerte. En un hexapéptido modelo liofilizado, la humedad residual, la temperatura y, sobre todo, el tipo de excipiente de carga influyeron de forma significativa en la degradación en estado sólido¹¹. La EMA indica que, para prevenir o reducir la degradación, los péptidos se almacenan en general refrigerados (5 °C ± 3 °C) o congelados (−20 °C ± 5 °C)¹. Las vías físicas son igual de importantes: la agregación depende de la secuencia, la concentración, el pH, la carga, las superficies e interfaces, la temperatura, la agitación y la liofilización¹³, y la adsorción a tubos de vidrio o plástico puede hacer que la concentración real no coincida con la nominal¹⁴.

La reconstitución inicia el reloj. El agua bacteriostática es agua estéril con 0,9 % u 1,1 % de alcohol bencílico en un envase multidosis; su etiqueta advierte que no debe usarse en neonatos y que las soluciones preparadas no deben almacenarse salvo que el fabricante del fármaco lo indique¹⁵. Los péptidos aprobados fijan periodos de uso concretos que salen de sus propios estudios: la tesamorelina reconstituida se gira sin agitar, se conserva a 20–25 °C y se desecha a los 7 días, y su frasco de agua bacteriostática a los 28 días¹⁶; la pluma de semaglutida se puede conservar 56 días tras el primer uso y no debe congelarse ni usarse si se congeló¹⁷. Esos plazos no son extrapolables a otros péptidos. El detalle de cada ruta está en estabilidad de los péptidos: del polvo liofilizado al vial reconstituido, y un ejemplo aplicado a un péptido concreto, en GHK-Cu: guía completa del péptido de cobre.

Falsificaciones y calidad deficiente: lo que encontraron los laboratorios

Los estudios de mercado muestran la distancia que puede haber entre lo declarado y lo medido. En un estudio de vigilancia de semaglutida vendida por farmacias ilegales en línea, los tres viales liofilizados recibidos se consideraron probablemente de calidad deficiente o falsificados: la cantidad de semaglutida superaba lo rotulado en 28,6–38,7 %, la pureza medida fue de 7,7–14,4 % frente al 99 % declarado y todos tenían endotoxinas¹⁸. En un análisis sistemático de los diez péptidos falsificados más frecuentes en un mercado europeo, comprados a farmacias ilegales en línea, la pureza de los péptidos con cisteína fue de 5–75 %, varias muestras tenían arsénico hasta diez veces por encima del límite de toxicidad para inyectables y una tenía plomo¹⁹. Otro informe halló Bacillus cereus hemolítico en dos péptidos inyectables ilegales²⁰.

Las consecuencias clínicas pueden ser graves. Una serie de casos describió a dos personas sin diabetes ni obesidad que se inyectaron semaglutida obtenida sin receta y llegaron en coma con hipoglucemia grave, hipopotasemia e hipotermia: la causa era insulina sintética²¹. La OMS emitió en 2024 una alerta por lotes falsificados de Ozempic detectados en tres países, con riesgo de dosis incorrecta, contaminación o ingredientes sustituidos, y recomendó comprobar el número de lote y el número de serie²². Incluso fuera de la falsificación hay problemas: en productos magistrales de tirzepatida combinada con análogos de vitamina B12 se identificó una impureza nueva y extendida, formada por la reacción entre ambas moléculas, cuyos efectos clínicos se desconocen²³. Los hallazgos de laboratorio se revisan en ¿Qué hay realmente en el vial? y el contexto clínico de estos fármacos, en GLP-1: guía completa de semaglutida, tirzepatida y más.

Preguntas abiertas

Quedan varias cuestiones sin resolver. La primera es la inmunogenicidad: las impurezas relacionadas pueden introducir epítopos de células T, y por eso se han propuesto marcos de evaluación del riesgo inmunogénico para péptidos y sus impurezas²⁴. La segunda es la falta de datos: para muchos péptidos fuera de los fármacos aprobados hay pocos datos publicados de estabilidad en forma reconstituida, y los principios disponibles provienen de proteínas, péptidos modelo y productos aprobados⁹¹¹¹³. La tercera es metodológica: los estudios de mercado analizan pocas muestras (tres viales en el caso de la semaglutida) y no permiten estimar la calidad media de un mercado¹⁸. Lo razonable es tratar la calidad como un dato que se verifica por lote, con métodos ortogonales y con un análisis independiente en los lotes clave¹⁴.